免疫熒光（IF）是在免疫學(xué)、生物化學(xué)和顯微鏡技術(shù)的基礎上建立起來(lái)的一項檢測技術(shù)?？捎糜跈z測和識別細胞和組織中蛋白質(zhì)及其他分子的亞細胞分布和遷移。那么你知道免疫熒光實(shí)驗的步驟有哪些嗎？讓我們一起來(lái)看看吧！

一、細胞準備

對于單層生長(cháng)的細胞，將細胞接種到預先處理過(guò)的蓋玻片的培養皿中，待細胞接近長(cháng)成單層后取出蓋玻片，用PBS洗滌兩次。

對于懸浮生長(cháng)的細胞，取對數生長(cháng)的細胞，用PBS離心洗滌（1000rpm, 5min）兩次，然后用細胞離心甩片機制備細胞片或直接制備細胞涂片。

二、固定

根據需要選擇適當的固定劑來(lái)固定細胞。

固定完畢后的細胞可置于含有疊氮納的PBS中，在4℃保存3個(gè)月。用PBS洗滌3次，每次洗滌5分鐘。

三、通透

對于使用交聯(lián)劑（如多聚甲醛）固定的細胞，一般需要在加入抗體之前進(jìn)行通透處理，以確?？贵w能夠到達抗原部位。選擇通透劑時(shí)應充分考慮抗原蛋白的性質(zhì)。通透時(shí)間一般在5-15分鐘。通透后用PBS洗滌3次，每次洗滌5分鐘。

四、封閉

使用封閉液對細胞進(jìn)行封閉處理，時(shí)間一般為30分鐘。

五、一抗結合

在室溫孵育1小時(shí)或者在4℃過(guò)夜。用PBST洗滌3次，每次沖洗5分鐘。

六、二抗結合

對于間接免疫熒光，需要使用二抗。在室溫避光孵育1小時(shí)。用PBST洗滌3次，每次沖洗5分鐘，然后再用蒸餾水洗滌一次。

七、封片及檢測

滴加一滴封片劑，然后封片，最后使用熒光顯微鏡進(jìn)行檢查。

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